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你不知道的實驗小技巧

平時在實驗室最常聽到的一句話就是「實驗為什么會是這樣的呢」。然后仔細一查找原因,往往是由于操作上面的不認真,或是一些小小的細節沒有注意到。

小編為大家整理了實驗小技巧,希望對大家有幫助。

質粒 DNA 提取

提取質粒的時候,最后一步的酒精揮發很關鍵,基本上是其后續的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發長一點時間,最好是空調吹熱風,或是 37℃ 溫箱放長一點的時間,我試過室溫過夜,酶切很好。

Amp 濃度提高到 200 ug/ml,下班前接種,次日一早收獲菌體,OD 雖然不高,質粒豐度卻不一般。菌體量少些,操作體積(管數)也小(少)。

手提質粒,如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提,注意一下手法,嚴格按照參考書上面的操作的話,提出的質粒不比任何質粒提取試劑盒差,我感覺好像還好一點,我就用過一次試劑盒,比較了之后不如我手提的好,以后再也沒用過了。

Western Blot

western blot 的時候,大家往往會摸索一抗、二抗的濃度,封閉時間,曝光時間等等,而每次變換其中的一個條件就需要重新跑膠、轉膜,甚至重新提蛋白,這樣會浪費大量的時 間。其實完全沒有必要這樣。一次轉膜后,將 PVDF 膜晾干,裁減成小塊,保存起來,用的時候取出一塊,沒有任何影響。這對于摸索條件的戰友來說,節約了大量的時間。

western blot 轉膜時,膠放在轉膜緩沖液中一段時間,待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉膜裝置,我的經驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預染 maker 條帶,方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預染 maker 很清楚,等轉膜后就不是分辨的很清楚了。要注意畫好預染 maker 后就不要使膠和膜發生對位移動了,以防 maker 失去參照價值。

器具的清潔非常重要,開始做前,為了安全,尤其是裝膠的厚薄玻璃板,可以先用中性洗滌劑和自來水反復沖洗,確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗 2-3 遍,然后用去離子水沖洗一遍。最后用 95% 酒精再擦一遍后晾干備用。

配膠最好現用現配,先配下層膠(分離膠),后配上層膠(濃縮膠或積層膠),而且在臨灌膠前加 APS 并迅速混勻,即用移液槍抽吸與注入1-2 次即可。

緩沖液和培養基配置

將緩沖液配方中的成分分別以 10-100 倍配成母液儲存,需要的時候只需將相應的母液混合,補加水稀釋即可;

培養基時通常會忘記各成分的量,如配 LB 時的三個成分不記得到底哪個是 5 g,哪個要 10 個,因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量,如配 LB 時,在 NaCl 瓶外注明 10 g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L 等,很方便,不需要每次配之前臨時翻書。

PCR

做克隆鑒定的時候經常需要在酶切鑒定前進行 PCR 鑒定,每次配制 PCR 反應液很繁瑣,可以將其配置類似kit的形式,按你需要的反應體系列表,然后放大 100 倍配制 100×主反應液(100 次反應),其中含 buffer,Mg2+,dNTPs,但不含引物和 Taq 酶,然后可以 10× 分裝或一管儲存在-20℃,在需要的時候拿出融開,然后按所需的 PCR 反應個數吸取相應的倍數,再補加相應反應倍數的 Taq 和引物,混勻后分裝。

這樣做的好處如下:可極大的節省寶貴的時間,可早點收工,看球;避免每次反應加樣不均的可能;大大減少 PCR 假陽性的產生。

酶切

如果是要做酶切,提質粒的最后一步最好是用水溶解 DNA,因為 TE 里面的離子會影響酶切的效率。

雙酶切制備克隆插入片段的載體,最好選擇帶有外源片段的質粒,是否酶切完全,從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷。空質粒單切完全和雙切完全在分子量上差異不大。

做酶切時,也可以象 PCR 一樣配制主反應液,每次反應前先列好反應的體系,算好需要的反應數,然后按所需反應的體系按所需反應數放大,加入 buffer、酶、水,質粒欄空缺,然后混合后按質粒 DNA 的體積分裝,然后再在每管中加入相應體積的質粒 DNA 酶切。

這樣做的好處如下,特別是當同時有十幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯:各反應成分均一;可大大減少限制型內切酶的使用;節省時間。

大腸桿菌轉化實驗

時候第一天涂的轉化平板、次日早晨轉化子可能長成的菌落比較大(1~2 mm 以上,BL21 就長得快),下一步轉化子做質粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔(勿帶出培養基),50 ul 酚/氯仿懸浮菌體,放置兩分鐘,加 40 ul TE 抽提,上層 TE 吸出后再氯仿抽提一次,吸取上層 TE 即質粒提取液。提取的質粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作,可以省去轉接液體試管的培養步驟,至少節省 6~8 h的時間。但是,要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果,不同的實驗室或者操作者未必能夠很方便地重復。

轉化時一定要做一個宿主菌的對照,即重組質粒涂板后再用宿主菌涂相應抗性的平板,以確定第二天長出來的克隆是否正確,我當時做了三次轉化之后才發現不成功竟然是由于 BL21 可以在 Amp(+)的平板上面生長。

蛋白質的表達、分離、純化

當蛋白大量的表達時,包含體的形成幾乎是不可避免的,而且很難通過改變一些誘導條件來改變,最有效的辦法就是換表達系統,所以如果時間還充分的話,可以嘗試一下,如果時間較短了,還是安心的做包含體蛋白的處理,變性之后的蛋白通過一些方法復性率也可以達到 60% 以上。

細胞凍存和復蘇實驗

可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶里,擰松瓶蓋,放到孵箱里半小時到 1 h,這樣溫度和 pH 值都已經最適合細胞生長了。

防止凍存管在升溫時爆裂等,可以在放入水浴前就提前在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭地放入水浴。細胞從液氮的 零下100 多度升到比如 - 80℃ 這個過程對細胞沒有損害。有足夠的時間處理這些。只不過一旦細胞化了,就應該爭分奪秒地把它放入培養液了,主要是為了稀釋 DMSO。常溫下高濃度 DMSO 對細胞的損害比較大。

水浴溫度 40℃ 應該也沒問題,但正規的 protocol 上從來都只說 37℃。反正應該相差不大,但不能太高了。另外,不必等細胞全化了再從水浴里取出來。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般最多水浴不超過 1.5 min。然后經過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了。每次都還有沒化的。先把已經融解的部分吸到培養瓶里,再從培養瓶里吸些培養液到凍存管里,余下的 冰塊瞬間就化了,再一起吸到培養瓶里。

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